当生信扯上免疫浸润，非肿瘤纯生信分析也可以轻松发7

原创不易

目前，免疫浸润已成为研究热点之一。然而，非肿瘤公共数据量少，想发7 的文章还是相对比较困难的。小编在查文献过程中，发现一篇近期发表在Frontiers in immunology（IF: 7.561）的非肿瘤纯生信文章“Identifying Immune Cell Infiltration and Effective Diagnostic Biomarkers in Rheumatoid Arthritis by Bioinformatics Analysis”，这篇文章挖掘了RA相关的关键基因和免疫浸润细胞类型，评估了关键基因的诊断效能及其与免疫细胞的相关性，进而揭示RA的免疫分子机制。结构非常清晰，思路也很简单，非常值得我们学习哦~

思

路

设

计

一、分析流程

图1分析流程图

二、主要结果

1.RA与正常滑膜组织的免疫细胞浸润

本文筛选了5个微阵列原始数据集，包括56个RA和41个正常滑膜组织，用于免疫细胞浸润的研究。去除批次效应后，共有55个RA和29个正常滑膜组织符合CIBERSORT分析条件。首先，每个样品中22种免疫细胞的组成以直方图（图2A）和热图（图2B）的形式呈现。在直方图中，颜色代表每个样本中不同免疫细胞的百分比，总和为1。在热图中，在热图中，每个样品中的免疫细胞都以标准化的绝对丰度显示。结果表明，M2巨噬细胞、CD8 T细胞、静息肥大细胞、naive B细胞、Tfh细胞、MO巨噬细胞和MI巨噬细胞是主要的浸润免疫细胞。然后评估RA滑膜组织中22种免疫细胞的相关性（图2C）。例如，Tfh细胞与记忆激活的CD4 T细胞和Ml巨噬细胞呈正相关。yò T细胞与记忆激活的CD4 T细胞和naive B细胞呈正相关。中性粒细胞与静息NK细胞、单核细胞和原始CD4 T细胞呈正相关。M2巨噬细胞与naive B细胞呈负相关。第三，基于滑膜组织中的免疫细胞浸润，通过PCA分析可以完全区分RA和HC（图2D）。

图2 RA和正常滑膜组织的免疫细胞浸润

采用Wilcoxon检验和LASSO回归两种不同的算法来识别RA和HC中免疫细胞浸润的显著差异。Wilcoxon检验结果显示，13种免疫细胞有显著差异（图3A）。LASSO分析结果显示，12种免疫细胞有显著差异（图3B, C）。交集分析得到10种免疫细胞。与HC MI巨噬细胞相比，RA滑膜组织中Tth细胞、记忆激活CD4 T细胞和浆细胞数量显著增加，而调节性T细胞、活化树突状细胞、活化NK细胞、记忆静息CD4 T细胞、静息肥大细胞、激活的肥大细胞在RA滑膜组织中显著降低。

图3 鉴别RA中显著差异的免疫细胞

2.DEGs识别

基于5个微阵列数据集，包括57个RA和41个正常样本，使用两种方法筛选DEGs。使用“批量校正”方法共获得360个DEGs，其中上调基因335个，下调基因25个。使用RRA方法共获得461个DEGs，其中上调基因298个，下调基因163个。图4A中显示了一些DEGs。将两种方法筛选的DEGs进行交集分析，共获得202个DEGs，其中上调基因179个，下调基因23个（图4B）。通过火山图（图4C）和热图（图4D）对最终的DEGs可视化。

图4 DEGs识别

3.功能相关性分析

将DEGs转化为基因ID后，对DEGs进行GO和KEGG分析。DEGs主要富集到免疫细胞的生物活性，如淋巴细胞分化、T细胞活化、白细胞（图5A，B）。DEGs主要富集到免疫细胞相关信号通路，例如趋化因子信号通路、类风湿关节炎、原发性免疫缺陷（图5C，D）。总之，DEGs的功能与免疫细胞显著相关。

图5 功能相关性分析

4.关键基因的鉴定与验证

基于STRING获得了DEGs的PPI网络结果，进一步使用10种算法计算每个节点的得分，最后通过R包“UpSet”筛选了5个关键基因（CXCR4、CCL5、CD8A、CD247和GZMA）（图6A）。合并后的微阵列数据通过heatmap显示了5个关键基因的表达水平（图6B）。为了使结果更加可靠，本研究使用RNA-Seq数据集GSE89408进行验证。热图显示了CXCR4、CCL5、CD8A、CD247和GZMA的表达水平（图7A）。如图7B-F所示，这5个基因在RA早期和已建立RA中的表达均显著高于HC。GZMA和CD8A在早期RA中的表达水平显著高于建立期RA。与上述结果一致，数据集GSE89408中CXCR4、CCL5、CD8A、CD247和GZMA在RA中的表达也明显高于骨关节炎（图7G）。因此，GZMA和CD8A可以作为早期RA的诊断标志物，CXCR4、CCL5和CD247可以作为RA的诊断标志物。

图7 关键基因的验证

5.生物标志物对RA的诊断效果

采用GSE89408数据集，通过ROC分析验证生物标志物对RA的诊断有效性。如图8A所示，CCL5、CXCR4和CD247的AUC值为0.835（95% CI 0.758-0.913）、0.900（95%CI 0.847-0.953）和0.797（95% CI 0.724-0.871）。CCL5和CXCR4联合AUC达到0.905（95%CI 0.852-0.957）。如图8B所示，GZMA和CD8A的AUC值为0.887（95%CI 0.819-0.956）和0.821（95%CI 0.725-0.918）。GZMA和CD8À联合AUC达到0.900（95%CI 0.837-0.963）。因此，CCL5 CXCR4和GZMA CD8A分别具有诊断RA和早期RA的能力，且具有良好的特异性和敏感性。

图8 RA生物标志物的诊断有效性

6.RA中生物标志物与差异免疫细胞的相关性

图9A展示了四种有效的生物标志物（CCL5、CXCR4、GZMA和CD8A）与10种显著差异免疫细胞在RA滑膜组织中的相关性。结果表明，CCL5与M1巨噬细胞呈正相关（R = 0.47, p = 0.00038）；CXCR4与记忆激活CD4 T细胞（R = 0.44, p = 0.00089）和Tfh细胞（R = 0.70, p = 5 e-09）呈正相关；GZMA与Tfh细胞呈正相关（R = 0.53, p = 5 e-05）（图9B-E）。

图9 RA中生物标志物与差异免疫细胞的相关性

三、结语